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在凯达高速冷冻离心机用硫氰酸胍离心法提取RNA

时间:2018-07-16    来源:湖南凯达科学仪器有限公司    点击量:750

在凯达高速冷冻离心机用硫氰酸胍离心法提取RNA

    用硫氰酸胍法取代酚/氯仿/异戍醇-乙醇法提取RNA,该方法是用高浓度的硫氰酸胍裂解纯化的细胞核,它是离液序列高的试剂,解离核酸蛋白质复合物,并在破碎过程中使细胞内核酸酶快速失活,然后通过稠密的CsCI垫层阻止DNA和蛋白质沉降,最后用脲-LiCI纯化回收RNA,该法也适合于从细菌、植物、动物组织里抽提RNA。本方法由Glisin等(1974)、Chirgwin等(1979)和AuffragRoageon(1980)等人建立和发展。

 

a. 把细胞核悬浮在5mol/L硫氰酸觚、5mmol/L  Tris-HCl50mmol/LEDTA5%(体积分数)2-巯基乙醇(PH=7.0)中,细胞核浓度为(1~5)×107/mL

b. 通过超声处理剪切DNA,使其分子量降低。

c. 加固体N-月桂酰(十二酰)肌氨酸钠到2%(质量浓度),当溶解肌酸时,把溶液在50℃加热2min

d. 给高速离心机水平转子的离心管里加5.7mol/L  CsCl50mmol/L  EDTAPH=7.0),再把含RNA溶液铺放在CsC1垫层上。CsC1垫层的体积是硫氰酸胍溶液0.25倍。

e. 15℃高速离心24~48hRNA形成沉淀,而蛋白质和DNA分布在溶液里,如下图所示。

5.7mol/L  CsCL上的细胞核(或整细胞)硫氰酸胍裂解物经高速水平转子离心后内容物分布图解如下图所示。

CsC1屏障法分离RNA

 

f. 用吸管吸出上清液直到DNA带(可以用透射折射和黏度来判断),倒出剩余溶液,把离心管颠倒放在棉纸上,使之彻底排于,以减少DNARNA的污染。

g. 从离心管底部0.5~1.0cm高度处把离心管切掉(把DNA区带占据的位置切掉),把干净的凝胶状RNA沉淀用1~2mL的灭菌水洗出。

h. 加入1/9体积的灭菌3mol/L 乙酸钠PH=7.0)、2.5倍体积的乙醇。放置于-20℃过夜使RNA沉淀。

i. 0℃、最大16000g离心10min收集RNA(凯达KH20R-Ⅱ高速冷冻离心机10000r/min),并重新悬浮在70%(体积分数)乙醇里洗沉淀,然后用95%乙醇洗(每次使用离心机的离心的条件都是一样的),再在真空干燥器里或再用干燥氮气使RNA干燥。

j. 除去残留在RNA里的微量DNA是把沉淀重新溶解在0.5mL的灭菌水里,与0.5mL 8mol/L脲、4mol/L LiCIPH=7.0)混合,混合物在4℃过,通过离心收集RNA沉淀,按步骤i清洗和干燥。

k. RNA沉淀重新悬浮在0.3mol/L乙酸钠PH=7.0)里,再加2.5倍体积的乙醇-20℃过夜,收集RNA沉淀,按步骤i清洗和干燥。

l. RNA可以脱水储存于-20℃,或者溶解在灭菌水里,分成小份储存于-20

至此,完成了使用凯达离心机对RNA的离心分离提取。

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